Die drei bereits erwähnten Städte, die bisher staatliche Eigenständigkeit besaßen, vereinigten sich mit den gleichfalls dorischen Städten Kos, Knidos und Halikarnaß und bildeten von nun an die dorische Hexapolis. Dabei handelte es sich um eine Vereinigung mit politischem und religiösem Charakter, deren Mittelpunkt das Heiligtum des Apollo Tripios bei Knidos war. Mit der Hexapolis sollte ein starker Städtebund als Gegengewicht zum Bund der Jonier mit ihrem Mittelpunkt, dem Heiligtum der Artemis in Ephesos, gegründet werden.
 
Im 5. und 4. Jahrhundert v. Chr. erlebte Rhodos viele kriegerische Auseinandersetzungen. Mit Jonien und Teilen der übrigen kleinasiatischen Küste geriet es unter die Herrschaft der Perser. Dies konnte erst beendet werden, als die Griechen erfolgreiche Kriege gegen die Perser führten.
 
Rhodos wurde darauf folgend Mitglied des Delischen Seebundes, der unter der Führung Athens stand. In den späteren Jahren, so auch zur Zeit des peloponnesischen Krieges, standen die Rhodier teils unter der Herrschaft Athens, teils unter der Herrschaft Spartas, um sich schließlich für Sparta zu entscheiden.
Noch während jener Bruderkrieg andauerte, entschlossen sich die drei größten Städte der Insel, aus Sicherheitsgründen eine neue Stadt zu errichten. Dem Rat Dorieus, dem Sohn des Olympiasiegers Diagoras, gründete man die neue Hauptstadt auf der nordöstlichen Spitze der Insel und gab ihr den Namen Rhodos. Die Gründung dieser Stadt im Jahre 408 v. Chr. beendete eine Phase der Geschichte dieser Insel.
 
Nach dem Einfluss Athens und Spartas gewann allmählich die Rolle Makedoniens in den politischen Verhältnissen Griechenlands an Bedeutung. Die Rhodier schlugen sich auf die Seite der Makedonier und ließen sogar die Errichtung einer makedonischen Festung in ihrer Hauptstadt zu. Bei der Belagerung von Tyros unterstützten sie Alexander den Großen.
 
Nach dem Zerfall des Reiches Alexander des Großen, unterhielt Rhodos enge wirtschaftliche und politische Beziehungen zum ptolemäischen Ägypten. Diese Beziehung war dem König Antigonos von Syrien ein Dorn im Auge, fürchtete er doch ein Bündnis zwischen Rhodos und Ägypten in einem Krieg, den er gegen Ägypten beabsichtigte. Um dem zuvorzukommen, entsandte er im Sommer des Jahres 305 v. Chr. seinen Sohn Demetrios Poliorketes, um Rhodos zu erobern.
Die Rhodier leisteten der gewaltigen Übermacht ein ganzes Jahr heftigsten Widerstand und zwangen den ruhmreichen Feldherrn, die Belagerung aufzuheben und die Insel geschlagen zu verlassen.

Die zurückgelassenen gefürchteten Belagerungsmaschinen, die für die damalige Zeit einen beachtlichen Wert darstellten, verkauften dann die Rhodier später, um mit ihrem Erlös den weltberühmten Koloss von Rhodos, das gewaltige Standbild des Sonnengottes Helios zu errichten.

Über die Pracht der hellenistischen Zeit haben viele Chronisten eindrucksvolle Berichte und Beschreibungen hinterlassen. Nach der Zerstörung von Tyros, dem größten Handelskonkurrent, erreichte Rhodos den Höhepunkt in seiner Entwicklung. Der Misserfolg des Feldherrn Demetrios Poliorketes bei der Eroberung von Rhodos, bedeutete den Beginn einer neuen Epoche. Handel und Schifffahrt der Stadt nahmen ein Ausmaß an, das bislang zu dieser Zeit keine andere Stadt erreicht hatte. In der Folge musste ein ordnungsgemäßer Ablauf der Schifffahrt gewährleistet werden. Aus diesem Grund setzten die Rhodier das Rhodische Seerecht in Kraft. Dieser internationale Kodex des See-rechtes, der als einer der wichtigsten juristischen Dokumente gilt, wurde dann von den Römern und Byzantinern übernommen und verbessert.

Ab dem 3. Jahrhundert v. Chr. machte sich das Eingreifen Roms in die politischen Verhältnisse des östlichen Mittelmeerraumes und Griechenlands immer stärker bemerkbar. Die Rhodier versuchten aus dieser Situation Nutzen zu ziehen und unterhielten fast immer freundschaftliche Beziehungen zu Rom. Die Römer aber beabsichtigten die Macht von Rhodos einzuschränken. Sie benutzten die mangelnde Bereitschaft der Rhodier sie im Krieg gegen Perseus zu unterstützen als Vorwand, den Hafen von Delos zum Freihafen zu machen. Dies war der Todesstoss für den rhodischen Handel. Um weiter existieren zu können, mussten die Rhodier folglich ein Bündnis mit Rom eingehen. Dies brachte großes Unglück über Rhodos sowohl in den Kriegen der Römer gegen ihre Gegner, wie auch in ihren Bürgerkriegen. Das Unheil kam in Gestalt von Cassius. Nach der Ermordung Cäsars lehnten die Rhodier es ab, Cassius im Kampf gegen seine Gegner zu unterstützen. Voller Wut erstürmte er 42 v. Chr. Rhodos und zerstörte es mit unbeschreiblicher Grausamkeit. Dabei brachte er mehr als 3000 Kunstwerke als Beute nach Rom.